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真核生物的染色体由染色质组成，染色质则是由核小体组成。核小体由一个组蛋白八聚体和缠绕在上面的DNA组成。核小体与核小体之间通过一段linker DNA连接。这些核小体在染色体中处于不同的染色质构象中：常染色质是结构比较松散的染色质，这种松散的结构使得DNA上的调控元件（启动子，增强子等）处于物理可接近的状态，从而可以被转录因子等蛋白结合，进而激活转录过程；异染色质结构比较紧密，DNA被压缩折叠，处于不可接近的状态，从而无法被转录因子等蛋白结合，无法激活转录。因此，染色质构象是基因表达调控的关键手段之一。ATAC-seq是目前染色质构象研究的主流工具。通过ATAC-seq可以在全基因组范围内检测染色质的开放程度，从而得到全基因组范围内的蛋白质可能结合的位点信息。除了研究组织特异性的染色质可及性模式，ATAC-seq也可以用来阐明细胞激活或信号传导引起的更即时的染色质可及性变化。在这篇文章中ATAC-seq技术被用来识别静息状态和刺激激活的免疫细胞之间的染色质可及性变化。整篇文章思路清晰，有很好的借鉴意义。

发表期刊：Epigenetics

发表时间：2021

研究背景

炎症性细胞因子，特别是白细胞介素-1（Interleukin-1, IL-1），在病原体和有害物质的宿主反应中发挥关键作用，针对IL-1相关细胞因子的抑制剂在临床治疗中具有重要价值，尤其是在自身炎症性疾病的治疗中（Palomo et al., 2015）。IL-1通过直接的信号通路介导的转录因子激活和调控元件结合，可以迅速引发基因表达的变化（Weber et al., 2010）。染色质的可及性变化与基因表达调控紧密相关。作者使用对IL-1刺激具有良好响应特性的软骨肉瘤细胞系SW1353作为实验材料，利用ATAC-seq技术，评估了细胞经IL-1处理后染色质可及性的变化，以及这些变化如何与基因表达调控相联系，进而为炎症性疾病的潜在治疗策略提供新的见解。

研究思路

技术路线图

研究结果

01. IL-1信号传导启动动态染色质可及性变化

为了研究IL-1刺激期间的动态染色质特征，作者在对照和IL-1刺激软骨肉瘤细胞系SW1353中进行ATAC-seq（每组3个重复）。通过比较对照样品和IL-1处理样品之间的峰，确定了241个显著区域的可及性发生变化（图1a），并绘制了STX8和DIPK1A/FAM69A基因位点内显著峰的基因组示例插图（图1b）以及所有峰和相对于TSS的显著峰分布图（图1c）。对比"所有峰值"或全基因组分布，241个显著差异可及区域在被标记为增强子的区域显著富集。（图1d）。另外通过与HeLa衍生KB细胞中受IL-1调控的基因组区域数据的比较（Weiterer et al., 2020），发现不同细胞类型对IL-1刺激的染色质可及性响应是具有一定的共性的。

02. IL-1驱动的可及染色质区域与RelA结合相关

其次，作者将鉴定到的这些显著差异可及区域进行基因注释，通过GO分析发现这些可接近性增加的区域与炎症反应或对外部刺激的反应相关的条目相关（图1e）。Motif分析确定了调节不同可及性区域的潜在转录因子，可及性增加的区域可能与RelA、IRF1/ZNF263、CEBPA和ELF3等蛋白有关，可及性降低的区域可能是ZNF263、RUNX1和STAT3等（图1f）。作者将通过ATAC-seq得到的peaks与HeLa衍生的KB细胞（IL-1刺激后）生成的RelA ChIP-seq数据集进行了比较（Allis et al., 2016），结果显示刺激后明显更容易接近的区域中有50%包含至少一个相关的RelA结合的ChIP-seq峰，比例明显增加，表明这些区域在IL-1刺激下对RelA有显著的亲和力（图1g）。

图1 ATAC-seq识别出IL-1刺激的软骨细胞中的峰。

03. 染色质可及性的动态改变与基因表达变化相关

为了确定染色质可及性的变化是否与基因表达变化相关，作者进行了全基因组基因表达微阵列分析。IL-1刺激导致408个基因上调和51个基因下调。典型的IL-1响应基因，包括IL8（CXCL8）、IL6、CCL2和NFKBIA，都显著上调（图2a）。然后将差异表达的基因与染色质可及性的变化相关联，发现可及性和基因表达改变之间存在正相关（图2b）。

注：图中标记的基因是后续选择用于功能验证的基因。

图2 差异可及区域与基因表达变化之间的相关性。

04. IL-1刺激后新的可及性区域可以充当增强子

为了检验IL-1诱导的基因位点中可及性增加的区域是否对基因诱导必需，作者采用CRISPR/Cas9技术敲除了MMP13、C1QTNF1、IKBKE和TNIP1位点（在IL-1刺激后，四个基因都上调表达）内的显著内含子可及区域，这些区域通过Motif分析和与IL-1诱导的RelA ChIP-seq峰值的交叉对比被识别为RelA结合位点（图3a）。结果发现，MMP13、C1QTNF1和IKBKE基因在IL-1刺激下的上调表达相应减少，而TNIP1基因的表达未受影响（图3b）。IL-1响应基因IL-8的表达未受这些区域敲除的影响，表明这些区域的敲除没有影响信号通路本身。接下来作者又做了dCas9-VPR转录激活实验，使用dCas9转录激活子（dCas9-VPR），向这些区域引入gRNA可以增强IL-1诱导的目标基因表达（图3c）。并且还使用荧光素酶报告基因系统在体外测试了这些增强子对IL-1的反应，证实了这些特定染色质区域在调控IL-1诱导的基因表达中的作用（图3d）。

图3 Cas9介导的假定增强子缺失对IL-1诱导的基因表达的影响。

案例小结

1、研究发现：通过ATAC-seq确定了126,483个开放染色质区域，其中241个区域在刺激后显示出显著的可及性差异，这些差异可及区域主要对应于基因组中被标记为增强子的区域。

2、转录因子分析：Motif分析发现在变得更加可及的区域中显著富集了RelA结合基序，ChIP-seq数据分析证实了RelA与这些区域的结合。

3、功能验证：作者还观察到差异染色质可及性与基因表达之间存在显著相关性。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除刺激后变得更加可及的区域，证实了这些区域在调控基因表达中的功能。这些区域在使用dCas9转录激活子时也显示出激活作用，并在细胞模型中表现出增强子活性。

4、总体来说，该篇文章的数据共同描述并在功能上验证了许多参与炎症信号传导的动态可及性染色质区域，这些发现有助于深入理解炎症信号如何通过染色质层面的调控影响基因表达，进而可能揭示新的治疗炎症性疾病的靶点。

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参考文献

[1] Barter M J, Cheung K, Falk J, et al. Dynamic chromatin accessibility landscape changes following interleukin-1 stimulation[J]. Epigenetics, 2021, 16(1): 106-119.

[2] Palomo J, Dietrich D, Martin P, et al. The interleukin (IL)-1 cytokine family–Balance between agonists and antagonists in inflammatory diseases[J]. Cytokine, 2015, 76(1): 25-37.

[3] Weber A, Wasiliew P, Kracht M. Interleukin-1 (IL-1) pathway[J]. Science signaling, 2010, 3(105): cm1-cm1.

[4] Weiterer S S, Meier‐Soelch J, Georgomanolis T, et al. Distinct IL‐1α‐responsive enhancers promote acute and coordinated changes in chromatin topology in a hierarchical manner[J]. The EMBO journal, 2020, 39(1): e101533.

[5] Allis C D, Jenuwein T. The molecular hallmarks of epigenetic control[J]. Nature Reviews Genetics, 2016, 17(8): 487-500.